基本原理
生物發光是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶,當外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物熒光素(luciferin),即可在幾分鐘內產生發光現象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下,催化熒光素的氧化反應才可以發光,因此只有在活細胞內才會產生發光現象,并且光的強度與標記細胞的數目線性相關。然后在體外利用敏感的CCD設備形成圖像。此外,熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動子,成為某種基因的報告基因,通過監測報告基因從而實現對目標基因的監測。
生物發光本質為化學熒光,熒光素被熒光素酶氧化的過程中可以釋放波長廣泛的可見光子,其波長范圍為460-630nm(平均波長560nm)。在哺乳動物體內,血紅蛋白是吸收可見光的主要成分,能吸收藍綠光波段中的大部分可見光;水和脂質主要吸收紅外線,但其均對波長為590-800nm的紅光近紅外線吸收能力較差,因此波長超過600nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織而被高靈敏CCD 檢測到。
熒光素發光反應原理
熒光發光是通過激發光激發熒光基團到達高能量狀態,而后產生發射光??紤]到不同熒光物質的發射光譜EX(excitation spectrum)和激發光譜 EM(emission 8pectrum)的不同, 要選擇對應的激發和發射濾片。
比較區別
| 優點 | 缺點 |
生物發光 | 特異性強,靈敏度高,且無自發熒光; 能夠進行精確定量; | 信號較弱,檢測時間較長; 需要高度靈敏的儀器設備; 需要底物; |
熒光成像
| 信號強度大,可直接觀察成像; 有多種蛋白和染料可用; | 存在非特異性熒光; 檢測深度受到局限; 需要不同波長激發光,難精確體內定量; |
應用如下
1.標記細胞,如疾病及藥物研究、干細胞研究、細胞凋亡研究;
2.標記基因,如轉基因動物模型研究,基因表達和藥物代謝研究;
3.標記DNA及RNA,特別是基因治療方面的應用;
4.標記細菌,如研究蛋白質相互作用、代謝等。利用活體生物熒光成像技術可以檢測到,并能連續觀察其對機體的侵染過程以及抗病毒藥物和抗生素對其病理過程的影響。
將攜帶熒光素酶編碼基因(Luciferase)的質?;虿《巨D染入細胞,再導入研究動物如大、小鼠體內,之后注入底物熒光素(通常以熒光素鉀鹽或鈉鹽的形式),通過生物發光成像技術(BLI)來檢測光強度變化,從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。